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植酸酶的耐熱性
植酸酶作為飼料添加劑，主要用于提高單胃動(dòng)物對(duì)飼料中植酸磷等物質(zhì)的利用率，降低磷的排放量，已經(jīng)獲得了廣泛的認(rèn)可。但在推廣應(yīng)用中還存在一些問(wèn)題，較為突出的是植酸酶的熱穩(wěn)定性問(wèn)題。飼料生產(chǎn)的制粒過(guò)程需要經(jīng)過(guò)高溫加熱，一般在75℃～80℃，同時(shí)為了殺死沙門氏菌，有時(shí)溫度高達(dá)90℃～95℃，植酸酶在這樣的溫度下很容易失去部分活力，甚至完全失活。在中國(guó)，顆粒飼料約占飼料總產(chǎn)量的70%，所以獲得高熱穩(wěn)定性的植酸酶是近年來(lái)植酸酶工業(yè)的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
現(xiàn)有的部分植酸酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性見(jiàn)表1。植酸酶制劑的熱穩(wěn)定性與植酸酶本身的熱穩(wěn)定性密切相關(guān)，但大部分熱穩(wěn)定性好的植酸酶的最適酶促反應(yīng)溫度也偏高，而最適酶促溫度接近40℃的植酸酶則熱穩(wěn)定性較差，所以目前的研究工作是尋找更高耐熱性且最適酶促溫度接近40℃的優(yōu)質(zhì)植酸酶，以促進(jìn)植酸酶的普遍推廣使用。
表1 部分植酸酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性
表1 部分植酸酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性
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來(lái)源 |
最適溫度 |
熱穩(wěn)定性 |
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A . ficuum2NRRL3135 |
58℃ |
在沒(méi)有穩(wěn)定劑存在的條件下，最高可以耐受65℃的高溫 |
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Aspergillus f umigatus |
70℃ |
100℃下加熱20min后，酶活僅損失10% |
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A . niger N25 |
60℃ |
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Aspergillus Oryzae M105 |
56℃ |
65℃時(shí)酶活性喪失80% |
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Thermomyces lanuginosus |
65℃ |
熱變性溫度75℃ |
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Penicillium Canescens |
60℃ |
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Bacillus Subtilis |
55℃ |
60℃1小時(shí)，活性減少90%；60℃2小時(shí)，活性全部喪失 |
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玉米Zea mays |
55℃ |
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番茄 |
45℃ |
50℃以下，活性保留80%；60℃以下，活性很快喪失 |
酶對(duì)溫度的敏感性不但與酶蛋白分子本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)，也與酶的濃度、純度、有無(wú)底物和保護(hù)劑的存在、介質(zhì)的pH值、離子強(qiáng)度等一系列條件有關(guān)。提高植酸酶熱穩(wěn)定性的主要途徑就是從這些方面入手的。
一、改變植酸酶分子結(jié)構(gòu)提高耐熱性
1、酶分子的生物修飾——糖基化修飾
真核生物的蛋白質(zhì)合成有復(fù)雜的翻譯后修飾過(guò)程，對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的性能有重要作用。由于翻譯后修飾的細(xì)微差異，同菌種同基因，不同分離菌株中表達(dá)產(chǎn)物的性質(zhì)也會(huì)出現(xiàn)一些差異。
翻譯后修飾中最主要的是糖基化修飾。糖基化修飾一般會(huì)提高重組酶的分子量，最佳酶促反應(yīng)溫度變化很小，但可以大幅度提高該酶的熱穩(wěn)定性。例如，設(shè)計(jì)新的表達(dá)載體使phyA基因在Saccharomyces cerevisiae中表達(dá)，由于S . cerevisiae表達(dá)系統(tǒng)的高度糖基化作用，重組酶的分子量達(dá)到120kD，比天然表達(dá)的phyA的分子量大50% 。重組酶的最適酶促反應(yīng)溫度55℃～60℃，比原酶的范圍更寬，未完全純化的重組酶在55℃與80℃下分別作用15min之后，酶活分別保留95%和75% ，而同樣條件作用后的商品酶PhyA酶活保留分別為72 %和51% 。該重組phyA經(jīng)去糖基化后，分子量變?yōu)?0kD，酶活只降低了9%，但酶的熱穩(wěn)定性大為降低，80℃加熱15min，酶活損失40%。該例說(shuō)明糖基化程度對(duì)該酶熱穩(wěn)定性的重要影響。
2、定點(diǎn)突變技術(shù)
Rodriguez等對(duì)E. coli pH215 酸性磷酸酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，用天冬氨酸替代酶蛋白多肽鏈中的幾個(gè)氨基酸殘基，增加酶分子潛在的糖基化位點(diǎn)的數(shù)目。突變體基因在P. pastoris 中表達(dá)，得到了糖基化程度、酶活性及熱穩(wěn)定性改變很大的突變體植酸酶。近年來(lái)的研究也表明，單一氨基酸的替換可以改變酶蛋白的熱穩(wěn)定性，尤其是Pro殘基對(duì)改善熱穩(wěn)定性的作用尤為顯著，可以作為植酸酶蛋白改造的一個(gè)思路。
3、一致性技術(shù)
“一致性技術(shù)(consensus technique)”用于創(chuàng)造新的植酸酶分子。其方法是將已知的PhyA的氨基酸序列放在一起比較，借助計(jì)算機(jī)的幫助，從中選擇對(duì)每一個(gè)氨基酸位點(diǎn)最保守的殘基，拼成序列，然后將最后確定的氨基酸序列翻譯成相應(yīng)的DNA序列，再選用合適的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)這個(gè)“人造的”目的基因進(jìn)行表達(dá)。
2002年，Lehmann等在13個(gè)植酸酶序列的基礎(chǔ)上，增加6個(gè)植酸酶的序列進(jìn)行一致性技術(shù)構(gòu)造，得到的新酶phyA210比以前得到的phyA21的熱穩(wěn)定性提高了7.4℃。對(duì)phyA210中4個(gè)不穩(wěn)定性氨基酸進(jìn)行回復(fù)突變，并且引入一個(gè)新的穩(wěn)定性氨基酸殘基，使phyA210的熱穩(wěn)定性從85.4℃進(jìn)一步提高到90.4 ℃。通過(guò)定點(diǎn)突變逐個(gè)檢測(cè)每個(gè)氨基酸殘基對(duì)熱穩(wěn)定性提高的貢獻(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)交換的38個(gè)殘基中每一個(gè)氨基酸殘基單獨(dú)對(duì)熱穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)都小于3℃，整體上熱穩(wěn)定性的提高是這些對(duì)該蛋白有穩(wěn)定作用的氨基酸共同作用的結(jié)果。
4、替換二級(jí)結(jié)構(gòu)
Jermutus等按照耐熱性niger植酸酶的晶體結(jié)構(gòu)，將Aspergillus A . terreus 植酸酶表面的一個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋用A .niger 植酸酶上相應(yīng)長(zhǎng)度的一段序列替換，獲得了酶活性未變而熱穩(wěn)定性提高的新植酸酶。盡管新酶中只有A . niger 植酸酶31個(gè)氨基酸序列，但新酶的熱穩(wěn)定性與A . niger 植酸酶相似。說(shuō)明這種熱穩(wěn)定性一定程度上是該二級(jí)結(jié)構(gòu)作用的結(jié)果。相對(duì)于隨機(jī)突變的大量篩選而言，該方法省去了篩選的繁重工作。
二、改變植酸酶的環(huán)境條件提高植酸酶的耐熱性
1、植酸酶的固定化
固定化酶廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)和研究領(lǐng)域，可以大大提高酶的穩(wěn)定性。已有研究人員在嘗試植酸酶的固定化應(yīng)用，用來(lái)制備肌醇多磷酸的系列化合物。以植酸酶為標(biāo)志酶，還發(fā)展出了通用于真菌來(lái)源的酶的新的固定化技術(shù)。固定化植酸酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性大為提高，是植酸酶利用的方向之一。
2、緩沖液和保護(hù)劑
在熱處理中所使用的緩沖液可以調(diào)節(jié)酶的熱穩(wěn)定性。重組表達(dá)的A . f umigatus 植酸酶經(jīng)高溫處理后，在10mmol/L和200mmol/L的醋酸鈉溶液中比在檸檬酸溶液中的殘留酶活性可以高20%～39%。另外，保護(hù)劑的添加也會(huì)大大增加酶的熱穩(wěn)定性，例如甘油、蔗糖、乙二醇溶液和無(wú)機(jī)鹽類等
3、包衣技術(shù)
將成型后的顆粒植酸酶采用包衣劑，在表面形成一層堅(jiān)固的薄膜，使植酸酶顆粒與外界隔離，避免制粒時(shí)的濕熱條件破壞植酸酶分子結(jié)構(gòu)，使植酸酶活性降低或完全失活。該薄膜要求在胃液中溶解釋放出植酸酶分子。若使用多種包衣劑，通過(guò)多次包衣形成多層薄膜，會(huì)進(jìn)一步提高植酸酶的熱穩(wěn)定性。
三、植酸酶耐熱性的評(píng)價(jià)
關(guān)于植酸酶產(chǎn)品耐溫性評(píng)價(jià)方法，基本是四種方法。馮定遠(yuǎn)等(2008)研究結(jié)果表明，濕熱法與實(shí)際調(diào)質(zhì)制粒對(duì)植酸酶處理結(jié)果具有最強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系（r=0.97），濕熱法是最適宜的快捷評(píng)價(jià)植酸酶耐熱性的實(shí)驗(yàn)室方法。該文獻(xiàn)評(píng)價(jià)方法總結(jié)見(jiàn)下表：
表2 植酸酶產(chǎn)品耐溫性評(píng)定方法
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方法 |
耐熱條件 |
溫度℃ |
與實(shí)際制粒相關(guān)系數(shù)r |
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緩沖液水浴法 |
吐溫20乙酸緩沖液水浴10分鐘 |
70、80、90 |
-0.62 |
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干熱法 |
恒溫烘箱熱空氣加熱10分鐘 |
70、80、90 |
0.09 |
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濕熱法 |
補(bǔ)水到16%恒溫烘箱熱空氣加熱10分鐘 |
70、80、90 |
0.97 |
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實(shí)際制粒 |
實(shí)際調(diào)質(zhì)后制粒 |
80 |
由于恒溫烘箱的不同高度、不同位置溫度差達(dá)到2～3℃，試驗(yàn)結(jié)果平行誤差較大。水浴鍋中不同位置的溫度差一般不超過(guò)0.1～0.2℃，同時(shí)目前實(shí)際制粒一般調(diào)質(zhì)水分到18%，所以我們采用將待測(cè)植酸酶樣品補(bǔ)加水分到18%后用鋁箔袋密封，采用水浴加熱到待測(cè)溫度，所得到的結(jié)果平行誤差較小。由于相同溫度下，水浴熱量傳遞速度和強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于熱空氣氣浴熱量傳遞速度和強(qiáng)度，即使水浴5分鐘，對(duì)植酸酶活性破壞力也遠(yuǎn)大于熱空氣氣浴10分鐘。
所以，我們將濕熱法調(diào)整為補(bǔ)充水分到18%，鋁箔袋密封后，在待測(cè)溫度下水浴加熱5分鐘。該方法評(píng)價(jià)植酸酶熱穩(wěn)定性更加合理。
四、昕大洋公司植酸酶產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性
通過(guò)多年大量的研發(fā)工作，通過(guò)基因重組、糖基化修飾、固定化技術(shù)和復(fù)合包衣技術(shù)等一系列技術(shù)的應(yīng)用，北京昕大洋科技發(fā)展有限公司植酸酶的熱穩(wěn)定性獲得了重大突破，新型耐高溫植酸酶顆粒產(chǎn)品95℃濕熱法酶活存留率達(dá)到90%以上，甚至100℃濕熱法酶活存留率也可以達(dá)到70%以上，該技術(shù)居于行業(yè)先進(jìn)水平。
五、未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)
雖然在提高植酸酶的熱穩(wěn)定性方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但植酸酶的應(yīng)用研究并非僅限于熱穩(wěn)定性，提高酶的綜合性能才是今后發(fā)展的關(guān)鍵所在。人們?cè)谔岣咧菜崦傅幕钚裕黾铀鼘?duì)蛋白酶的抵抗性，獲得最適宜的pH性質(zhì)等方面也已經(jīng)做了很多工作，并取得了豐碩的成果，今后在這些方面一定會(huì)有更多突破，使植酸酶有更廣泛的應(yīng)用。
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