植酸是谷物、豆類、油籽和堅(jiān)果中磷的主要貯存形式，其含量在1～5%左右。動(dòng)物飼料中總磷的1/3是可消化的無機(jī)磷，其余的2/3則以有機(jī)磷的形式存在。單胃動(dòng)物（如豬、禽）由于其胃腸道內(nèi)不分泌或只分泌很少量的降解植酸的酶――植酸酶，故不能消化利用植酸磷。植酸酶的研究和生產(chǎn)為單胃動(dòng)物充分利用飼料中的磷資源開辟了新的途徑，顯著降低了飼料成本，同時(shí)大大減少了畜禽糞便對(duì)生態(tài)環(huán)境造成的磷污染。近年來，隨著植酸酶研究的不斷深入和分子生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，人們對(duì)植酸酶生化特性的認(rèn)識(shí)也越來越深刻。鑒于此，本文對(duì)植酸酶生化特性的最新研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。
 

        1. 植酸酶的分類

        生物化學(xué)命名聯(lián)合會(huì)（JCBN）列出了兩類植酸酶：即肌醇六磷酸－3－磷酸水解酶（EC 3.1.3.8）和肌醇六磷酸－6－磷酸水解酶（EC 3.1.3.26）。在近期的撰文中，Mullaney和Ullah按照結(jié)構(gòu)和催化特性把植酸酶分為三類，包括組氨酸酸性磷酸酶（HAPs）、β－螺旋植酸酶（BPP）和紫色酸性磷酸酶（PAP）。

        2. 植酸酶的生化特性

        植酸酶是一種酯水解酶，不同來源的植酸酶，其分子量約為35～700 kDa，活性pH值范圍通常為4.5～6.0。
 

        2.1 提純與特性
        黑曲霉 NRRL 3135植酸酶（即phyA、phyB和最適pH為6.0的酸性磷酸酶）屬于分泌蛋白，在缺乏磷的淀粉培養(yǎng)基上，它們的分泌量相對(duì)較高。這些蛋白的提純譜表明總分泌蛋白的50%為phyA、phyB和最適pH為6.0的酸性磷酸酶。分泌的糖蛋白在5℃可穩(wěn)定保存幾個(gè)月，且缺乏固有的蛋白酶活性，這樣就容許在室溫下利用離子交換層析和層析聚焦法對(duì)其進(jìn)行純化。由于它們的糖基化不同，因此這些蛋白被證明是微生物異源蛋白。phyA，phyB和最適pH為6.0的酸性磷酸酶單體的分子量分別約為85、65和85 kDa。通過分析真菌植酸酶對(duì)肌醇6-，5-，4-，3-磷酸的Kcat/Km值，發(fā)現(xiàn)肌醇六磷酸是phyA和phyB的最適底物，因此將它們歸為植酸酶。Casey和Walsh通過離子交換、凝膠過濾和層析聚焦提純并鑒定了來自黑曲霉 ATCC 9142的植酸酶，它是一種耐熱的胞外酶，該酶的 最適溫度為65℃，最適pH為5.0，具有較寬的底物特異性，與市場(chǎng)上的植酸酶相比，在80℃表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性。
        Kerovuo等提純了來自枯草芽胞桿菌 VTT E-68013的植酸酶(phyC)，其最適溫度為55℃，最適pH為7.0。提純后的酶是一種金屬離子依賴性酶，因?yàn)槠浞€(wěn)定性和活性的發(fā)揮均需鈣離子的參與。Kerovuo等也研究了枯草芽胞桿菌植酸酶的金屬離子需要，發(fā)現(xiàn)用EDTA去除金屬離子后酶完全失活，再用鈣孵育后可部分復(fù)活。通過圓二色法推測(cè)，酶失活的原因可能是分子構(gòu)象發(fā)生了變化。Golovan等提純了來自大腸桿菌的植酸酶，分子量為45 kDa，利用層析聚焦法將其進(jìn)一步分為同樣大小的兩種異構(gòu)體，等電點(diǎn)分別為6.5和6.3。異構(gòu)體表現(xiàn)出相似的最適溫度和pH，即60℃和pH 4.5。Stahl等把大腸桿菌appA基因克隆到紫青紫鏈霉菌中，并將其與在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)的基因相比，他們發(fā)現(xiàn)非糖基化植酸酶的耐熱性在45和55℃，比糖基化的植酸酶高，但在65和75℃又分別低80%和94%。
        Tambe等從來自產(chǎn)氣克雷伯氏菌的植酸酶中分離出兩種異構(gòu)體，它們的分子量、等電點(diǎn)、Km、熱穩(wěn)定性、最適pH和溫度均不相同。據(jù)報(bào)道這是第一例保留了全部植酸酶活性的分子量?jī)H為10～13 kDa的小片段植酸酶。Segueilha等用柱層析法從卡斯許旺酵母產(chǎn)生的植酸酶中提純了一種490 kDa的四聚體植酸酶(大亞基為125 kDa，其它三個(gè)相同的小亞基為70 kDa)，此酶的最適溫度為77℃，最適pH為4.4，能使植酸鹽完全脫磷。來自丁香假單胞菌MOK1的植酸酶（EC 3.1.3.8）用陰陽(yáng)離子交換層析法提純后，在40℃和pH 5.5表現(xiàn)出最大活性和較強(qiáng)的底物特異性。Kim等對(duì)來自布氏檸檬酸桿菌的胞內(nèi)植酸酶進(jìn)行了12,800倍的純化，使其達(dá)到同質(zhì)化，其活性為3457 U/mg，這比以前報(bào)道的大腸桿菌植酸酶的活性高1.9倍。
總的說來，植酸酶在50～70℃表現(xiàn)出較高的活性，其最適溫度多在45～60℃之間。
        2.1.1 催化特性
當(dāng)植酸酶完全降解植酸后最終釋放出肌醇和正磷酸，其中間產(chǎn)物有單-，2-，3-，4-和5-肌醇酯。因此，植酸酶的活性測(cè)定可通過檢測(cè)正磷酸或低級(jí)肌醇磷酸鹽的量來進(jìn)行。通常用比色法測(cè)定無機(jī)磷，其要從無機(jī)溶劑中提取生成的磷鉬酸鹽。最近，反相C18 HPLC法被用來進(jìn)行植酸或低級(jí)肌醇磷酸鹽的分離和定量測(cè)定。植酸酶的活性單位被定義為每秒每毫升釋放出的磷的納摩爾數(shù)（nkat/s）。在檢測(cè)條件下，植酸酶對(duì)植酸具有很高的特異性，利用這一特性可以將其與酸性磷酸酶區(qū)分開來，因酸性磷酸酶是不能降解植酸鹽的。為了研究植酸酶氨基酸序列的自然變異以及它們對(duì)其催化活性的影響，Brugger等克隆并超量表達(dá)了來自六個(gè)新煙曲霉隔離種群的植酸酶基因。在所有蛋白中，來自煙曲霉變體的植酸酶更具變異性（86％的氨基酸序列同源性），其比活更高，并具有明顯不同的催化特征。
        2.1.2 動(dòng)力學(xué)和底物選擇
對(duì)植酸鹽脫磷酸的動(dòng)力學(xué)參數(shù)已進(jìn)行了廣泛的研究。植酸的米氏常數(shù)（Km）在17 μM（香蒲植酸酶）到91μM（玉米植酸酶）范圍內(nèi)變化，無花果曲霉植酸酶的米氏常數(shù)為40 μM。盡管植酸酶對(duì)植酸是相當(dāng)特異的，但其底物特異性會(huì)因分子特征不同而有所變化。一般情況下，酶的水解率符合經(jīng)典米－曼氏動(dòng)力學(xué)，即磷的釋放依賴于底物濃度。通常情況下都認(rèn)為無機(jī)磷酸鹽會(huì)抑制植酸鹽的水解（競(jìng)爭(zhēng)性抑制），而在特定條件下，當(dāng)植酸鹽濃度高于1.2 mM時(shí)會(huì)發(fā)生底物抑制。Ullah和Sethumadhavan對(duì)無花果曲霉和枸杞孢伏革菌 (PL)的植酸酶phyA進(jìn)行了提純和定性研究，發(fā)現(xiàn)二聚體PL植酸酶比AF植酸酶短26個(gè)殘基，AF植酸酶是一種單體蛋白。雖然在58 ℃和pH 5.0條件下，PL植酸酶（22,000 nkat/mg）比AF植酸酶（3000 nkat/mg）表現(xiàn)出更高的比活性，但AF植酸酶比PL植酸酶的耐熱性好（65 ℃）。盡管兩者的活性位點(diǎn)相似，但其轉(zhuǎn)換數(shù)、最適pH及在高溫和堿性條件下的穩(wěn)定性卻明顯不同，這表明它們適于在不同的環(huán)境下對(duì)植酸酶進(jìn)行降解，這是由不同的進(jìn)化歷程導(dǎo)致的。
        2.1.3 低級(jí)肌醇六磷酸鹽異構(gòu)體的探測(cè)
        對(duì)肌醇磷酸鹽進(jìn)行有效分析是很困難的，因?yàn)樗鼈儾晃湛梢姽夂妥贤夤?，也不能用特定的比色試劑進(jìn)行識(shí)別鑒定。通常用氯化鐵作沉淀劑來測(cè)定這些化合物，然而，這種方法是不充分的，并且缺乏鑒別各種異構(gòu)體所需的特異性。隨著離子偶HPLC方法的發(fā)展，才使對(duì)肌醇六磷酸鹽水解產(chǎn)物的研究成為可能，但這些方法也不能區(qū)分肌醇磷酸鹽的各種異構(gòu)體形式，因?yàn)樘荻认疵摬荒苓M(jìn)行RI的探測(cè)。Mayr針對(duì)聚陰離子發(fā)展了一種新的以染料絡(luò)合和過渡金屬為基礎(chǔ)的后柱探測(cè)系統(tǒng)，稱作“金屬－染料探測(cè)”，這種方法可在皮摩爾數(shù)量級(jí)上對(duì)多磷酸非放射性化合物進(jìn)行異構(gòu)體選擇性測(cè)定。同時(shí)各種各樣的肌醇磷酸鹽（包括所有的四個(gè)五磷酸鹽和四個(gè)四磷酸鹽）可用梯度離子層析結(jié)合后柱衍生法進(jìn)行確定。據(jù)報(bào)道，有人通過帶有RI探測(cè)器的反相C18柱HPLC法檢測(cè)了肌醇和肌醇磷酸鹽。然而遺留問題是如何從各種肌醇磷酸鹽（IP1－IP6）中分離出各種異構(gòu)體。Skoglund等發(fā)展了一種靈敏的高性能離子色譜法（HPIC）用于各種異構(gòu)體（IP1－IP6）的分離和定量測(cè)定，該方法利用了帶有梯度洗脫的高性能離子交換柱，通過后柱反應(yīng)或化學(xué)抑制電導(dǎo)法進(jìn)行探測(cè)。
   

        2.2 固定化研究
        植酸酶按順序作用于肌醇六磷酸鹽釋放出各種低級(jí)異構(gòu)體。因此，一個(gè)有效的固定化生物反應(yīng)器不但能釋放金屬離子和蛋白等，還可產(chǎn)生各種植酸異構(gòu)體。Quan等將克魯斯假絲酵母細(xì)胞固定在海藻酸鈣膠粒中來制備各種肌醇磷酸鹽，并用離子交換色譜將純異構(gòu)體分離出來，通過NMR（核磁共振）分析，除了肌醇五磷酸之外，他們得到了其它各種肌醇磷酸的單一異構(gòu)體。Gautam等以無花果曲霉和少孢根霉為發(fā)酵菌種，利用聚苯乙烯作惰性固體載體，在pH 6.0、30 ℃和水分58.3％的條件下進(jìn)行固體發(fā)酵產(chǎn)出胞外植酸酶。Ullah和Cummins通過將黑曲霉 NRRL 3135 phyA植酸酶共價(jià)固定在Fractogel TSK HW-75F上構(gòu)建了一種填充床生物反應(yīng)器。盡管最適pH未見發(fā)生變化，但最適溫度卻由58℃升至65℃ ，對(duì)植酸鹽的Km值也升高了，并使磷的釋放高出50%。在生物反應(yīng)器中使植酸鹽反復(fù)水解之后，用HPLC對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行分析，在洗出液中僅探測(cè)到了肌醇磷酸和肌醇二磷酸。據(jù)觀察，當(dāng)通過蛋白質(zhì)主鏈對(duì)植酸酶進(jìn)行固定化時(shí)，植酸酶的活性和生物反應(yīng)器的產(chǎn)量都有所降低。這可能由于在酶與蛋白基質(zhì)進(jìn)行廣泛交聯(lián)時(shí)植酸酶活性中心發(fā)生扭曲的緣故。由于天然植酸酶已被嚴(yán)重糖基化，所以阻止廣泛交聯(lián)是困難的。通過位點(diǎn)直接突變，有可能去除糖基化的殘基，從而產(chǎn)生的植酸酶能被部分碳水化合物固定并保持高活性。Greiner和Konietzny通過將大腸桿菌植酸酶共價(jià)固定在NHS活化Sepharose 上，提高了其耐熱性。Liu等把無花果曲霉植酸酶的最適溫度提高到58℃，比自由狀態(tài)的植酸酶高8℃，這是通過將酶固定在明膠中并用甲醛硬化實(shí)現(xiàn)的，其表觀Km提高到3.28 mM（自由酶：Km＝2.34 mM），酶的剩余活性僅為34.6%。
 

        2.3 植酸酶工程研究
        熱穩(wěn)定性酶的工業(yè)重要性正日益提高，因此，除了研究酶的熱穩(wěn)定性之外，酶的分離、定性和酶工程也都成了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。熱穩(wěn)定性是酶成功應(yīng)用于動(dòng)物飼料中的先決條件，因?yàn)橐?jīng)受60～90℃的制粒過程。故旨在提高植酸酶在各種條件下催化活性的酶工程設(shè)計(jì)將產(chǎn)生巨大效益。Tomschy等通過合理誘變改變了植酸酶（煙曲霉和共有序列植酸酶）的pH活性曲線，使之更適合于植酸酶在動(dòng)物飼料工業(yè)中的應(yīng)用。Lehmann等利用一種新奇的共有序列方法提高了真菌植酸酶的固有耐熱性，經(jīng)過對(duì)來自六種不同真菌的13種植酸酶進(jìn)行序列比較研究以及對(duì)每個(gè)殘基的最保守位置進(jìn)行選擇，重新構(gòu)建了共有序列植酸酶，其熱穩(wěn)定性得到了提高。之后，他們又納入了另外六個(gè)植酸酶序列的共有氨基酸序列，并通過位點(diǎn)直接誘變研究了38種氨基酸的取代作用。在共有植酸酶序列中引入穩(wěn)定化的氨基酸提高了植酸酶－1和植酸酶－10的伸展溫度，這一做法證明利用共有序列概念對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造來提高其熱穩(wěn)定性是有效的。

        3. 展望

        雖然報(bào)道了相當(dāng)數(shù)量的可產(chǎn)生植酸酶的微生物，但應(yīng)看到，對(duì)具有寬泛底物特異性和高比活的熱穩(wěn)定及酸穩(wěn)定的植酸酶仍然是非常期待的，這種植酸酶應(yīng)用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域?qū)⒕哂芯薮蟮纳虡I(yè)價(jià)值。